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Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.Baecher-Allan, C., Kaskow, BJ & Weiner, HL Multiple Sklerose: Mechanismen und Immuntherapie.Neuron 97, 742–768 (2018).Artikel CAS Google ScholarLee, H.-G., Wheeler, MA & Quintana, FJ Funktion und therapeutischer Wert von Astrozyten bei neurologischen Erkrankungen.Nat.Rev. Drug Discovery 21, 339–358 (2022).Artikel CAS Google ScholarLinnerbauer, M., Wheeler, MA & Quintana, FJ Astrozyten-Crosstalk bei ZNS-Entzündung.Neuron 108, 608–622 (2020).Artikel CAS Google ScholarWheeler, MA et al.Umweltkontrolle von astrozytenpathogenen Aktivitäten bei ZNS-Entzündung.Zelle 176, 581–596.e518 (2019).Artikel CAS Google ScholarBörner, K. et al.Anatomische Strukturen, Zelltypen und Biomarker des humanen Referenzatlas.Nat.Zellbiol.23, 1117–1128 (2021).Artikel ADS Google ScholarGinhoux, F., Yalin, A., Dutertre, CA & Amit, I. 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Glimcher für die Bereitstellung von Xbp1fl/fl-Mäusen;allen Mitgliedern der Quintana- und Abate-Labors für hilfreiche Ratschläge und Diskussionen;und das NeuroTechnology Studio am Brigham and Women's Hospital für die Bereitstellung des Instrumentenzugangs.Der Inhalt dieses Manuskripts liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH wieder.Diese Autoren haben zu gleichen Teilen beigetragen: Iain C. Clark und Michael A. WheelerDiese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Francisco J. Quintana und Adam R. AbateAnn Romney Zentrum für neurologische Erkrankungen, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USAIain C. Clark, Michael A. Wheeler, Hong-Gyun Lee, Zhaorong Li, Liliana M. Sanmarco, Shravan Thaploo, Carolina M. Polonio, Giulia Scalisi, Joseph M. Rone, Federico Giovannoni, Marc Charabati, Camilo Faust Akl, Dulce M. Alemann & Francisco J. QuintanaDepartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, School of Pharmacy, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USAIain C. Clark & ​​Adam R. AbateDepartment of Bioengineering, College of Engineering, California Institute for Quantitative Biosciences, QB3, University of California Berkeley, Berkeley, CA, USAIain C. Clark & ​​Seung Won ShinBroad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USAMichael A. Wheeler, Zhaorong Li und Francisco J. QuintanaVaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USAAmy R. Henry, Daniel C. Douek & Eli A. BoritzForschungslabor für Neuroimmunologie, Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), Montreal, Quebec, KanadaStephanie EJ Zandee & Alexandre PratSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenICC, MAW, EAB, FJQ und ARA gestalteten die Forschung.ICC, MAW, H.-GL, LMS, CMP, ST, SWS, GS, ARH, MC, CFA, DMA, JMR und FG führten Experimente durch.ICC, MAW, ZL, FJQ und ARA analysierten Daten.DCD, SEJZ und AP stellten einzigartige Materialien zur Verfügung und/oder diskutierten Ergebnisse.ICC, MAW, FJQ und ARA haben das Papier mit Beiträgen der Co-Autoren verfasst.FJQ und ARA leiteten und überwachten die Studie.Korrespondenz mit Francisco J. Quintana oder Adam R. Abate.Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.Nature dankt Lawrence Steinman und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.Hinweis des Herausgebers Springer Nature bleibt neutral in Bezug auf Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.(a) Featureplots der Aqp4- und Edem1-Expression in Zellen, die während der EAE aus dem ZNS der Maus isoliert wurden, reanalysiert aus Lit.22. (b) Violin-Plots von Aqp4 und Edem1 nach Cluster aus Astrozyten, die aus dem EAE-ZNS in einem aus Lit. re-analysierten Datensatz isoliert wurden.22. (c) Mikroskopische Aufnahmen von Agarosekügelchen, die eingefangene Nukleinsäuren aus eingekapselten Zellen enthalten.(d) Tröpfchenzytometrie-Plots, die eine Schätzung der Anzahl der eingefangenen Zellen (> 1 Million) in dem in (c) gezeigten Perlenvolumen zeigen.(e) Negativkontrolle der Tröpfchenzytometrie SYBR-Fluoreszenz.(a) Schema einer Blasenauslösevorrichtung, die die luftausgelöste Tröpfchenbildung während der Zellverkapselung antreibt.(b) Die luftgetriggerte Tröpfchenbildung ermöglicht die kHz-Erzeugung von Kügelchen aus viskoser geschmolzener Agarose.Bilder aus Zeitraffervideos des Zerfalls von Agarose-Jets.(c) Die Funktionalisierung von Agarose mit Allylgruppen wird verwendet, um akryditierte Primer direkt zu verknüpfen.(d) Mikroskopbilder, die die erfolgreiche Konjugation von polyT-Primern an Agarose mit polyA-FAM-Sonden zeigen.(e) Quantifizierung von Agarose-gebundenem polyT.(a) Sterisches Einfangen von zellulärer genomischer DNA innerhalb der Agarosematrix.Links: Hellfeldaufnahme von Agarosegelen.Rechts: Grüne SYBR-Fluoreszenz gefärbter Genome in Agarosegelen.Die Zellen werden bei Grenzverdünnung geladen, um eine Einzelzellverkapselung sicherzustellen;etwa jedes zehnte Agarose-Hydrogel enthält eine Zelle.(b) Geschätzte Anzahl von Zellen pro Tropfen basierend auf Poisson-Statistiken für mikrofluidische Beladung während FIND-seq.(c) Quantifizierung von lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von AmCyan-Farbstoff für lebende/tote Zellen.n = 4 Mäuse.(d) Die Amplifikation des gesamten Transkriptoms (WTA) von cDNA, die kovalent an Agarosekügelchen gebunden ist, zeigt, dass Material in voller Länge eingefangen und revers transkribiert wird.(e) WTA-Ausbeute als Funktion der PCR-Zykluszahl.(f) Optimierung des cDNA-Einfangs mit Pufferzusammensetzung, Enzym, Template-Switch-Oligonukleotidkonzentration und Additiven (6 mM Mg2+, 1 M Betain und 7,5 % PEG-8000).(g) Quantifizierung der prozentualen mitochondrialen Lesevorgänge in Massen-FIND-seq-Daten für jede Wiederholung.n = 22 Proben.(h) Berechnung der Punktzahl pro Zelle aus Astrozyten, abgeleitet von scRNA-seq aus Lit.22 oder jede Bulk-FIND-seq-Replikation für den Signalweg GOBP: Ausführungsphase der Apoptose (GO: 0097194).(a) Schema der Mikrofluidik zur Reinjektion von Agarose-eingefangenen Genome.(b) Mikroskopbild einzelner Agarose-Hydrogel-Kügelchen in Tröpfchen mit gemessener Größe für jedes Tröpfchen und jede Agarosekugel.(c) Optimierung der Tröpfchenerkennungs-PCR, um die cDNA-Qualität während des Thermocyclings zu erhalten.(d) Nachweis eines HIV-Genom-DNA-Ziels in Einzelkopie durch FIND-seq in infizierten menschlichen JLat-Zellen, aber nicht in nicht infizierten Jurkat-Kontrollzellen, als Proof-of-Concept-Experiment zum Testen der FIND-seq-Sensitivität und -Spezifität.Das DNA-Ziel wurde mit TaqMan-PCR im FIND-seq-Workflow (Schritt 3 in Abb. 1d) amplifiziert, gefolgt von der Detektion durch Tröpfchenzytometrie (Schritt 4 in Abb. 1f).(e) Schema der Mikrofluidik zur Tröpfchensortierung unter Verwendung eines konzentrischen dielektrophoretischen Designs.(f) Mikroskopische Aufnahmen der Tröpfchensortierung.Oben: Zeitrafferbilder aus einem Video zur Tröpfchensortierung, die die Tröpfchenablenkung in den Sammelkanal zeigen.Unten: Ohne FPGA-Sortierungsauslösung werden Tröpfchen über den Bias-Ölfluss im äußeren Abfallkanal gehalten.(a) Quantifizierung des Prozentsatzes Aquaporin-4-exprimierender Zellen in naiven Mäusen durch Antikörper-basierte Durchflusszytometrie (n = 4);FIND-seq (n = 3) oder scRNA-seq, reanalysiert aus Lit.22. (b) Validierung der FIND-seq-Spezifität und -Sensitivität durch die Analyse von AQP4+- und AQP4-Zellen, die durch Durchflusszytometrie isoliert und FIND-seq unterzogen wurden.Die Prozentsätze zeigen die Anzahl der Zellen, die Aqp4 in jeder Population exprimieren, basierend auf einer Beladung mit 70 % Kügelchen.(c) PCA-Plot der Bulk-FIND-seq-Analyse von Aqp4+Edem1-Zellen.(d) Vergleich der Nachweisempfindlichkeit von FIND-seq mit vergleichbaren Technologien.(e) Korrelation der rohen Expressionszahlen pro Gen zwischen Massen-FIND-seq-sortierten Aqp4+Edem1+-Zellen und Edem1+-Astrozyten, die aus tröpfchenbasierten scRNA-seq-Daten extrahiert wurden, über die wir zuvor in22 berichtet haben.(f) Quantifizierung des Anteils doppelter Lesevorgänge über Bulk-RNA-seq-Plattformen hinweg.(g) Quantifizierung von Ern1 in Massen-FIND-seq-Daten als Funktion der EAE- und Edem1-Expression.(h) Berechnung eines Signatur-Scores für Transkripte, die in Astrozyten-Endfüßen angereichert sind, wie von Lit. berichtet.51, analysiert in Astrozyten aus Lit.22 und Massen-FIND-seq.(a) Visualisierung eines einzelnen Tröpfchens in Mikrotiterplatten mit flachem Boden.Lichtbrechung an Vertiefungskanten verdeckt die Bildgebung.Dies wird durch direktes Sortieren in Hexadecan gelöst.HFE-Öl sinkt und bildet eine konvexe Form, die Tröpfchen in die Mitte drückt, damit sie abgebildet werden können.(b) Der Prozentsatz der Lesevorgänge, die nach der Einzelzellsortierung von Zellmischungen auf Maus- oder menschliche Zellen abgebildet werden.Maus- (3T3) und menschliche (JLat) Zellen wurden 1:100 gemischt, basierend auf einer TaqMan-PCR sortiert, die auf JLat-Zellen abzielt, und das Transkriptom wurde sequenziert.(c) Qualitätskontrollanalysen für scFIND-seq.(d) Markergene von Aqp4+Edem1+/–-Zellen aus naiven oder EAE-Mäusen, analysiert durch scFIND-seq.(e) Elbow-Plot der von scFIND-seq erkannten Hauptkomponenten.(a) Vorhergesagte Upstream-Regulatoranalyse, die Nr3c2 und Xbp1 aus Bulk-FIND-seq-Daten unter Verwendung von Qiagen IPA zeigt.Differentiell exprimierte Gene wurden als Eingabe verwendet und die Überlappung mit dem von jedem Molekül kontrollierten Regulon wurde berechnet.Fishers exakter Test.(b) Links: Vorhersage von Nr3c2 als Upstream-Regulator in Aqp4+Edem1+-Zellen, analysiert durch FIND-seq während EAE unter Verwendung von Qiagen IPA wie in (a).Fishers exakter Test.Rechts: Identifizierung eines NR3C2-Motivs durch SeqPos in Genen, die in Aqp4+Edem1+- gegenüber Aqp4+Edem1-Zellen in EAE herunterreguliert sind.(c) UMAP-Diagramm von Aqp4+Edem1+-Zellen aus EAE-Mäusen, analysiert durch scFIND-seq.(d – e) Vorhersage von Upstream-Regulatoren (d) und Pathway-Analyse (e) basierend auf Qiagen IPA in Cluster 1-Astrozyten, analysiert aus Aqp4 + Edem1 + -Zellen in EAE-Mäusen, gezeigt in (c).Fishers exakter Test.(f) Schema eines lentiviralen Vektors, der eine sgRNA enthält, die auf Kandidatengene und spCas9 unter der Kontrolle eines Gfap-Promotors abzielt.Fortschreiten der EAE-Krankheit in Mäusen, die mit sgScrmbl und Kandidaten-sgRNA-Lentiviren transduziert wurden.n = 4–5 Mäuse pro Bedingung.(a) Links: Upstream-Regulator-Analyse von RNA-seq-Daten durch Qiagen IPA von auf sgNr3c2 gerichteten versus auf sgScrmble gerichteten Mäusen zeigt eine NR3C2-Herunterregulierung.Fishers exakter Test.Rechts: Validierung des NR3C2-Knockdowns durch Immunfärbungsquantifizierung.n = 6 Bilder pro Gruppe von n = 3 Mäusen.Ungepaarter zweiseitiger t-Test.(b–c) FACS-Analyse der gesamten CD4+-Zellen oder FoxP3+-, IFN𝛾+-, IL17+- und IL10+-CD4-Zelluntergruppen in (b) der Milz und (c) im ZNS.(d) Validierung des NCOR2-Knockdowns durch Immunfärbung.n = 6 Bilder pro Gruppe von n = 3 Mäusen.Ungepaarter zweiseitiger t-Test.(e–f) FACS-Analyse von CD4+-Gesamtzellen oder FoxP3+-, IFN?+-, IL17+- und GM-CSF+-CD4-Zelluntergruppen in (e) der Milz und (f) ZNS.(a) FACS-Analyse von Astrozyten und Mikroglia im ZNS.n = 3 pro Gruppe.(b) Validierung von XBP1 KO durch Immunfärbung.n = 6 Bilder von n = 3 Mäusen pro Gruppe.Ungepaarter zweiseitiger t-Test.(c–d) FACS-Analyse von CD4+-Gesamtzellen oder FoxP3+-, IFN𝛾+- und GM-CSF+-CD4+-T-Zell-Untergruppen aus (c) der Milz und (d) dem ZNS von Xbp1WT- und Xbp1Astro-Mäusen.(e) Pfade, die durch voreingestellte Genset-Anreicherungsanalyse (GSEA) von Genen aus RNA-seq-Daten analysiert wurden, die Xbp1WT- und Xbp1Astro-Mäuse verglichen.( a - b ) Reanalyse von ATAC-seq-Daten zu Massendurchflusszytometrie-sortierten Astrozyten, über die wir in Lit. berichtet haben.4, die eine erhöhte Chromatinzugänglichkeit in NR3C2-responsiven Genen (a) und in Nr3c2 und Ncor2 (b) als Funktion des Gfap-spezifischen shRNA-gesteuerten lentiviralen Knockdowns von Xbp1 zeigt.CAD-Datei für das Mikrofluidikgerät mit Blasenauslöser.CAD-Datei für das mikrofluidische Co-Flow-Reinjektionsgerät.CAD-Datei für das mikrofluidische Tröpfchensortierer-Gerät.Normalisierte Zählmatrix von Massen-FIND-seq-Daten, die Aqp4+Edem1+/–-Zellen von naiven oder EAE-Mäusen vergleichen.Genexpression durch Cluster von scFIND-seq-Daten von Aqp4+Edem1+/–-Zellen von naiven oder EAE-Mäusen.Differentielle Expressionsanalyse von Bulk-RNA-seq-Daten von Astrozyten, die aus sgNr3c2-Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu sgScrmbl-Mäusen.Differentielle Expressionsanalyse von Bulk-RNA-seq-Daten von Astrozyten, die aus sgNcor2-Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu sgScrmbl-Mäusen.Differentielle Expressionsanalyse von Bulk-RNA-seq-Daten von Astrozyten, die aus Aldh-creERT2;Xbp1fl/fl KO-Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu Xbp1fl/fl-Mäusen.Springer Nature oder sein Lizenzgeber (z. B. eine Gesellschaft oder ein anderer Partner) besitzt die exklusiven Rechte an diesem Artikel im Rahmen einer Veröffentlichungsvereinbarung mit dem/den Autor(en) oder anderen Rechteinhaber(n);Die Selbstarchivierung der akzeptierten Manuskriptversion dieses Artikels durch den Autor unterliegt ausschließlich den Bedingungen dieser Veröffentlichungsvereinbarung und dem anwendbaren Recht.Clark, IC, Wheeler, MA, Lee, HG.et al.Identifizierung von Astrozytenregulatoren durch Nukleinsäurezytometrie.Natur 614, 326–333 (2023).https://doi.org/10.1038/s41586-022-05613-0DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05613-0Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedItDurch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich mit unseren Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einverstanden.Wenn Sie etwas missbräuchlich finden oder unseren Bedingungen oder Richtlinien nicht entsprechen, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.Nature (Nature) ISSN 1476-4687 (online) ISSN 0028-0836 (print)Melden Sie sich für den Newsletter „Nature Briefing: Translational Research“ an – Schlagzeilen aus den Bereichen Biotechnologie, Wirkstoffforschung und Pharma.